ફાસ્ટકિંગ વન સ્ટેપ આરટી-પીસીઆર કિટ

A-1 RNA ની અધોગતિ થાય છે

No કોઈ દૂષણ વગર ઉચ્ચ ગુણવત્તાની આરએનએ શુદ્ધ કરો. જે સામગ્રીમાંથી આરએનએ કા isવામાં આવે છે તે આરએનએના અધોગતિને રોકવા માટે શક્ય તેટલી તાજી હોવી જોઈએ. આરટી પ્રતિક્રિયા પહેલાં વિકૃત જેલ પર આરએનએ અખંડિતતાનું વિશ્લેષણ કરો. આરએનએ નિષ્કર્ષણ પછી, તે 100% ફોર્મામાઇડમાં સંગ્રહિત થવું જોઈએ. જો RNase અવરોધકનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો ગરમીનું તાપમાન <45 ° C હોવું જોઈએ, અને pH 8.0 કરતા ઓછું હોવું જોઈએ, અન્યથા અવરોધક તમામ બંધાયેલ RNase ને છોડશે. તદુપરાંત, RNase અવરોધક solutions 0.8 mM DTT ધરાવતા ઉકેલોમાં ઉમેરવું જોઈએ.

A-2 RNA માં વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયાઓના અવરોધકો છે

રિવર્ઝ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શન ઇન્હિબિટર્સમાં એસડીએસ, ઇડીટીએ, ગ્લિસરોલ, સોડિયમ પાયરોફોસ્ફેટ, સ્પર્મિડાઇન, ફોર્મામાઇડ, ગ્યુનાઇડિન મીઠું વગેરેનો સમાવેશ થાય છે, અને નિયંત્રણ આરએનએને નમૂના સાથે મિક્સ કરો, અને કંટ્રોલ આરએનએ પ્રતિક્રિયા સાથે ઉપજની તુલના કરો. અવરોધકોને દૂર કરવા માટે 70% (v/v) ઇથેનોલ સાથે RNA વરસાદ ધોવા.

A-3 સીડીએનએના પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડના સંશ્લેષણ માટે વપરાતા પ્રાઇમર્સની અપૂરતી એનેલીંગ

- એ નક્કી કરો કે પ્રયોગમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાઇમર્સ માટે એનિલીંગ તાપમાન યોગ્ય છે. રેન્ડમ હેક્સામેર માટે, પ્રતિક્રિયા તાપમાન સુધી પહોંચતા પહેલા 10 મિનિટ માટે તાપમાન 25 ° સે રાખવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે. જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ (જીએસપી) માટે, અન્ય જીએસપી અજમાવો, અથવા ઓલિગો (ડીટી) અથવા રેન્ડમ હેક્સામેર પર સ્વિચ કરો.

A-4 આરએનએ શરૂ કરવાની નાની રકમ

- RNA ની માત્રામાં વધારો. 50 એનજીથી ઓછા આરએનએ નમૂનાઓ માટે, 0.1 μg થી 0.5 μg acetyl BSA નો ઉપયોગ પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ સીડીએનએ સંશ્લેષણમાં થઈ શકે છે.

A-5 વિશ્લેષિત પેશીઓમાં લક્ષ્ય ક્રમ વ્યક્ત થતો નથી.

- અન્ય પેશીઓનો પ્રયાસ કરો.

A-6 PCR પ્રતિક્રિયા નિષ્ફળ જાય છે

-બે-સ્ટેપ RT-PCR માટે, PCR સ્ટેપમાં cDNA ટેમ્પલેટ રિએક્શન વોલ્યુમના 1/5 કરતા વધારે ન હોઈ શકે.

A-1 પ્રાઇમર્સ અને નમૂનાઓનું બિન-વિશિષ્ટ એનેલીંગ

-પ્રાઇમર્સના 3'-અંતમાં 2-3 ડીજી અથવા ડીસી હોવું જોઈએ નહીં. રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ અથવા ઓલિગો (ડીટી) ને બદલે પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ સિન્થેસિસમાં જીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરો. પ્રથમ થોડા ચક્રમાં anંચા annealing તાપમાન, અને પછી નીચા annealing તાપમાન વાપરો. પ્રતિક્રિયાની વિશિષ્ટતાને સુધારવા માટે પીસીઆર માટે હોટ-સ્ટાર્ટ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરો.

A-2 જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સની નબળી ડિઝાઇન

- એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઇમર ડિઝાઇન માટે સમાન સિદ્ધાંતોને અનુસરો.

A-3 RNA જીનોમિક DNA થી દૂષિત

-પીસીઆર-ગ્રેડ DNase I સાથે RNA નો ઉપચાર કરો. DNA દૂષણ શોધવા માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન વગર નિયંત્રણ પ્રતિક્રિયા સેટ કરો.

A-4 પ્રાઇમર ડિમેરની રચના

3 'ઓવરને અંતે પૂરક સિક્વન્સ વગર પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરો.

A-5 ખૂબ Mgંચો Mg²⁺ એકાગ્રતા

Mgપ્ટિમાઇઝ એમજી²⁺ દરેક નમૂના અને બાળપોથી સંયોજન માટે એકાગ્રતા

એ -6 વિદેશી ડીએનએથી દૂષિત

-એરોસોલ-પ્રતિરોધક ટીપ્સ અને UDG ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ કરો.

A-1 પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ પ્રોડક્ટની સામગ્રી ખૂબ વધારે છે

- પરંપરાગત પીસીઆર રિએક્શન સ્ટેપમાં પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ પ્રોડક્ટની માત્રામાં ઘટાડો.

PCR પ્રતિક્રિયામાં A-2 ખૂબ priંચી પ્રાઇમર રકમ

- પ્રાઇમર ઇનપુટ ઘટાડવું.

A-3 ઘણા બધા ચક્ર

પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિને શ્રેષ્ઠ બનાવો અને પીસીઆર ચક્રની સંખ્યા ઘટાડવી.

A-4 ખૂબ નીચું annealing તાપમાન

બિન-વિશિષ્ટ પ્રારંભ અને વિસ્તરણને રોકવા માટે neનીલિંગ તાપમાનમાં વધારો.

A-5 ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ ટુકડાઓનું બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ડીએનએના ડીએનએઝ ડિગ્રેડેશન દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે-ડીએનએ દૂષણને રોકવા માટે ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા આરએનએ બહાર કાો.

RT-PCR એ RNA ને cDNA માં ફેરવવાનું છે, અને પછી લક્ષ્યના ટુકડાને વધારવા માટે PCR પ્રતિક્રિયા માટે નમૂના તરીકે વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્ટેડ cDNA નો ઉપયોગ કરવો. પ્રયોગની ચોક્કસ શરતો અનુસાર રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ, ઓલિગો ડીટી અને જનીન વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ પસંદ કરો. ઉપરોક્ત તમામ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ ટૂંકા યુકેરીયોટિક સેલ mRNA માટે હેરપિન સ્ટ્રક્ચર વગર કરી શકાય છે.

રેન્ડમ પ્રાઇમર: હેરપિન સ્ટ્રક્ચર સાથે લાંબા આરએનએ, તેમજ આરઆરએનએ, એમઆરએનએ, ટીઆરએનએ, વગેરે જેવા તમામ પ્રકારના આરએનએ માટે યોગ્ય છે તેઓ મુખ્યત્વે સિંગલ ટેમ્પલેટની આરટી-પીસીઆર પ્રતિક્રિયા માટે વપરાય છે.

ઓલિગો ડીટી: પોલીએ ટેઇલિંગ સાથે આરએનએ માટે યોગ્ય (પ્રોકાર્યોટિક આરએનએ, યુકેરીયોટિક ઓલિગો ડીટી આરઆરએનએ અને ટીઆરએનએમાં પોલિએ પૂંછડીઓ નથી). કારણ કે ઓલિગો ડીટી પોલીએ ટેઇલ સાથે બંધાયેલ છે, આરએનએ નમૂનાઓની ગુણવત્તા beંચી હોવી જરૂરી છે, અને અધોગતિની થોડી માત્રા પણ પૂર્ણ-લંબાઈના સીડીએનએ સંશ્લેષણની માત્રામાં મોટા પ્રમાણમાં ઘટાડો કરશે.

જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર: નમૂના ક્રમ માટે પૂરક, પરિસ્થિતિઓ માટે યોગ્ય જ્યાં લક્ષ્ય ક્રમ જાણીતો છે.

ત્યાં બે માર્ગો છે:

1. આંતરિક સંદર્ભ પદ્ધતિ: સિદ્ધાંતમાં, સીડીએનએ વિવિધ લંબાઈના ડીએનએ ટુકડા છે, તેથી ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસનું પરિણામ સમીયર છે. જો આરએનએ વિપુલતા ઓછી હોય, તો ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસમાં કોઈ ઉત્પાદન દેખાશે નહીં, પરંતુ આનો અર્થ એ નથી કે પીસીઆર દ્વારા કોઈ ઉત્પાદન વધારવામાં આવશે નહીં. સામાન્ય રીતે, આંતરિક સંદર્ભનો ઉપયોગ સીડીએનએ શોધવા માટે થઈ શકે છે. જો આંતરિક સંદર્ભમાં પરિણામો હોય, તો સીડીએનએની ગુણવત્તા મૂળભૂત રીતે ખાતરી આપી શકાય છે (કેટલાક કિસ્સાઓમાં, જો લક્ષ્ય જનીન ટુકડો ખૂબ લાંબો હોય, તો અપવાદો હોઈ શકે છે).

2. જો આ નમૂના દ્વારા કોઈ જાણીતું જનીન વિસ્તૃત છે, તો તે આ જનીનના પ્રાઈમરો દ્વારા ચકાસી શકાય છે. આંતરિક સંદર્ભના વિસ્તરણનો અર્થ એ નથી કે સીડીએનએ સાથે કોઈ સમસ્યા નથી. કારણ કે આંતરિક સંદર્ભમાં સીડીએનએમાં ઉચ્ચ વિપુલતા છે, તે વિસ્તૃત કરવું સરળ છે. જો વિવિધ કારણોસર સીડીએનએ આંશિક રીતે અધોગતિ પામે છે, તો સંભાવનાના દ્રષ્ટિકોણથી, ઓછી વિપુલતા લક્ષ્ય જનીનોના પીસીઆર પરિણામો મોટા પ્રમાણમાં પ્રભાવિત થશે. જ્યારે આંતરિક સંદર્ભ હજુ પણ વિપુલ પ્રમાણમાં highંચો છે, એમ્પ્લીફિકેશનને કદાચ અસર થશે નહીં.

RNA નું આંશિક અધોગતિ. આરએનએની અખંડિતતા શોધો અને શુદ્ધ કરો

જુદી જુદી પ્રજાતિઓની આરએનએ સામગ્રી અલગ હોઈ શકે છે, પરંતુ સામાન્ય રીતે, કા extractવામાં આવેલા કુલ આરએનએમાં જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસમાં બે સ્પષ્ટ 28 એસ અને 18 એસ બેન્ડ હોવા જોઈએ, અને પહેલાના બેન્ડની તેજસ્વીતા પછીના કરતા બમણી હોવી જોઈએ. 5S બેન્ડ સૂચવે છે કે RNA ની અધોગતિ થઈ છે, અને તેની તેજસ્વીતા અધોગતિની ડિગ્રીના પ્રમાણમાં છે. આંતરિક સંદર્ભના સફળ વિસ્તરણનો અર્થ એ નથી કે આરએનએ સાથે કોઈ સમસ્યા નથી, કારણ કે આંતરિક સંદર્ભ ઉચ્ચ વિપુલતામાં છે, જ્યાં સુધી અધોગતિ ગંભીર ન હોય ત્યાં સુધી આરએનએ વિસ્તૃત કરી શકાય છે. આ OD₂₆₀/OD₂₈₀સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર દ્વારા માપવામાં આવતા શુદ્ધ આરએનએનો ગુણોત્તર 1.9 અને 2.1 ની વચ્ચે હોવો જોઈએ. આરએનએમાં પ્રોટીનની અશુદ્ધિની થોડી માત્રા ગુણોત્તર ઘટાડશે. જ્યાં સુધી મૂલ્ય ખૂબ ઓછું નથી ત્યાં સુધી RT ને અસર થશે નહીં. RT માટે સૌથી મહત્વની બાબત RNA અખંડિતતા છે.

આંતરિક સંદર્ભ જનીનનું વિસ્તરણ માત્ર સૂચવી શકે છે કે આરટી સફળ થયું છે, પરંતુ તે સીડીએનએ સ્ટ્રાન્ડની ગુણવત્તા સાથે સંબંધિત નથી. કારણ કે આંતરિક સંદર્ભ ટુકડાઓ સામાન્ય રીતે કદમાં નાના અને અભિવ્યક્તિમાં ,ંચા હોય છે, તેથી તેઓ વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શનમાં સફળ થવામાં સરળ છે. જો કે, લક્ષ્ય જનીનનું કદ અને અભિવ્યક્તિ જનીનથી જનીનમાં બદલાય છે. સીડીએનએની ગુણવત્તા ફક્ત આંતરિક સંદર્ભ દ્વારા જ નક્કી કરી શકાતી નથી, ખાસ કરીને 2 કેબી કરતા વધુ લાંબા લક્ષ્ય ટુકડાઓ માટે.

કેટલાક નમૂનાઓમાં જટિલ ગૌણ માળખા હોય છે, અથવા સમૃદ્ધ GC સામગ્રી હોય છે, અથવા ઓછી વિપુલતા સાથે કિંમતી હોય છે. આ કિસ્સાઓમાં, લક્ષ્ય ટુકડાના કદ અને નમૂના અનુસાર યોગ્ય વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્ટસ પસંદ કરવું જોઈએ. ઉચ્ચ GC સામગ્રી અને જટિલ ગૌણ માળખું ધરાવતા RNA નમૂનાઓ માટે, નીચા તાપમાને, અથવા સામાન્ય વિપરીત ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટેઝ સાથે ગૌણ માળખું ખોલવું મુશ્કેલ છે. આ નમૂનાઓ માટે, ક્વોન્ટ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટસ પસંદ કરી શકાય છે, કારણ કે તેનું વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રદર્શન એમ-એમએલવી શ્રેણીના વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ કરતા સ્પષ્ટ રીતે વધુ સારું છે, જે વિવિધ આરએનએ નમૂનાઓને અસરકારક રીતે ઉલટાવી શકે છે અને આરએનએને સીડીએનએ પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડમાં મહત્તમ હદ સુધી લખી શકે છે. સામાન્ય રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટેસ કીટનો ઉપયોગ કરતી વખતે, 20 μl સિસ્ટમ કુલ આરએનએના 1 μg ને માત્ર અસરકારક રીતે ઉલટાવી શકે છે. કૃપા કરીને કીટની મહત્તમ આરટી ક્ષમતા પર ધ્યાન આપો. જો નમૂનો વધારેમાં ઉમેરવામાં આવે તો, વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન ઉચ્ચ વિપુલતા સાથે આરએનએની તરફેણ કરશે. તેથી, સિસ્ટમની મહત્તમ ક્ષમતાથી વધુ ન કરવું તે વધુ સારું છે.

A-1 નક્કી કરો કે આરએનએ ગંભીર રીતે ઘટી ગયું છે અને જો આરટી સફળ છે

સામાન્ય રીતે, આંતરિક સંદર્ભ વિસ્તરણની નિષ્ફળતાનું કારણ ઘણીવાર ગંભીર આરએનએ અધોગતિને કારણે થાય છે. અન્ય સંભવિત કારણ વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન નિષ્ફળતા છે. સીડીએનએ સિંગલ સ્ટ્રાન્ડની ગુણવત્તાનો ન્યાય કરવા માટે આંતરિક સંદર્ભનો ઉપયોગ ધોરણ તરીકે કરી શકાતો નથી, પરંતુ જો આરએનએ ગુણવત્તાની કોઈ સમસ્યા ન હોય તો વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન સફળ છે કે કેમ તે નક્કી કરવા માટે તેનો ઉપયોગ ધોરણ તરીકે થઈ શકે છે. વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રક્રિયામાં સૌથી મહત્વની બાબત એ છે કે પ્રતિક્રિયાની કાર્યક્ષમતામાં સુધારો કરવા માટે સતત તાપમાન અને સતત પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી જાળવવી.

A-2 નક્કી કરો કે આંતરિક સંદર્ભ જનીનોને વધારવા માટેના પ્રાઇમર્સ વિશ્વસનીય છે અને જો PCR માં ઉપયોગમાં લેવાતા રીએજન્ટ સાથે કોઈ સમસ્યા હોય તો.

સાપેક્ષ જથ્થા માટે, રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શન પહેલા આરએનએનું પ્રમાણ હોવું જરૂરી છે, જે ઘણી રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શન કિટમાં પણ જરૂરી છે, ઉદાહરણ તરીકે, આરએનએ ઇનપુટને 1 μg તરીકે માપવું. રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રાઇબ સીડીએનએ મિશ્ર ઉકેલ છે, જેમાં આરએનએ, ઓલિગો ડીટી, એન્ઝાઇમ, ડીએનટીપી, અને થોડો ડીએનએ અવશેષો પણ છે, તેથી વિચલન થશે, તેથી સીડીએનએની ચોક્કસ માત્રા નક્કી કરવી અશક્ય છે. તેથી, આરએનએનું પ્રમાણ નક્કી કરવું જરૂરી છે. વિભિન્ન નમૂનાઓમાં વિપરીત ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા સમાન છે તે ધ્યાનમાં લેતા, મેળવેલ સીડીએનએની માત્રા સમાન હોવી જોઈએ અને જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ કુલ આરએનએની સમાન માત્રામાં વિવિધ જનીનોના અભિવ્યક્તિ સ્તરની સરખામણી બતાવી શકે છે. સાપેક્ષ ફ્લોરોસન્સ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર કરતી વખતે, વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન પછી માત્રાત્મક સીડીએનએની જરૂર પડી શકે નહીં કારણ કે આંતરિક સંદર્ભ જનીન સંદર્ભ તરીકે કાર્ય કરી શકે છે.

તે મુખ્યત્વે જનીનો સાથે સંબંધિત છે, અને મોટા ભાગના જનીનો માટે લાંબા ટુકડાનું વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન શક્ય નથી. પ્રથમ, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનની કાર્યક્ષમતા PCR કરતા ઘણી ઓછી છે. બીજું, જીસી સમૃદ્ધ પ્રદેશ અને ઘણા જનીનોનું ગૌણ માળખું વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને પીસીઆર બંનેને પ્રતિબંધિત કરે છે. છેલ્લે, પીસીઆરની વફાદારી અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા એક જ સમયે ગેરંટી આપવી મુશ્કેલ છે. રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શનની પ્રક્રિયામાં, ખાસ કરીને ઓલિગો ડીટીનો ઉપયોગ કરીને, ઓછી કોપી જનીનો માટે લાંબા ટુકડા મેળવવાની કોઈ ખાતરી આપી શકતું નથી. વધુ જીસી સાથે 5 'યુટીઆર માટે, તે વધુ મુશ્કેલ છે. તેથી, રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ સાથે ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટને ઉલટાવી દેવા, લક્ષ્યના ટુકડામાં કુદરતી ક્લીવેજ સાઇટ્સ શોધવા, સેગમેન્ટ્સ દ્વારા વિસ્તૃત કરવા અને પછી પ્રતિબંધ પાચન અને બંધન કરવા માટે તે હજુ પણ એક વાજબી પદ્ધતિ છે. સામાન્ય રીતે, 2 kb કરતા મોટા ટુકડાઓને સીધા વધારવા મુશ્કેલ છે, પરંતુ તે મેળવવું હંમેશા અશક્ય નથી: 1. સૌ પ્રથમ, RNA/mRNA ની અખંડિતતાની ખાતરી આપે છે, અને TRIZOL નિષ્કર્ષણને પ્રાધાન્ય આપવામાં આવે છે. 2.M-MLV RT-PCR કિટનો સીધો ઉપયોગ કરી શકાય છે. એનિલીંગનો સમય વધારવો અને એમ્પ્લીફિકેશન પ્રક્રિયામાં સાયકલ નંબરને યોગ્ય રીતે વધારવો. વૈકલ્પિક રીતે, નેસ્ટેડ પીસીઆર લાગુ કરી શકાય છે, અથવા સામાન્ય પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પહેલા યોગ્ય રીતે વિસ્તૃત વિકૃતિકરણ અને વિસ્તરણ સમય સાથે એક અથવા બે પ્રતિક્રિયાઓ કરી શકે છે, જે ટુકડાઓ વધારવામાં મદદ કરી શકે છે. પોલિમરેઝની વફાદારી પર ધ્યાન આપો. 3. આદર્શ પરિણામો મેળવવા માટે PCR માં લાંબા તાકનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. 4. પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ એપ્લિકેશન માટે, ઉચ્ચ વફાદારી પોલિમરેઝ લાગુ થવી જોઈએ.

TIANGEN દ્વારા બે પ્રકારના રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્ટસ આપવામાં આવે છે: ક્વોન્ટ/કિંગ RTase અને TIANScript M-MLV. તેમની વચ્ચેનો મુખ્ય તફાવત નમૂનાઓનો ઇનપુટ જથ્થો છે. ક્વોન્ટ એક અનન્ય વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ છે, જે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા M-MLV થી અલગ છે જે મોલોની મુરિન લ્યુકેમિયા વાયરસમાંથી પ્રાપ્ત થાય છે. ક્વોન્ટ એક નવી ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ છે જે એન્જિનિયરિંગ એસ્ચેરીચિયા કોલી દ્વારા પુનbસંવેદનશીલ રીતે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે. ઉચ્ચ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પ્રવૃત્તિ અને ઉચ્ચ ઉપજ સાથે 50 એનજી -2 Rg આરએનએ વધારવા માટે ક્વોન્ટ યોગ્ય છે. સામાન્ય એમએમએલવી અથવા એએમવીની તુલનામાં, ક્વોન્ટની સૌથી મોટી લાક્ષણિકતા એ છે કે તે આરએનએ નમૂનાઓ સાથે ખૂબ જ મજબૂત સંબંધ ધરાવે છે અને ઉચ્ચ તાપમાન વિકૃતિકરણ વિના ટ્રાન્સક્રિપ્ટ જટિલ નમૂનાઓને ઉલટાવી શકે છે. ઉચ્ચ GC સામગ્રીવાળા નમૂનાઓ માટે, વિપરીત કાર્યક્ષમતા વધારે છે. જો કે, આ રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્ટેસમાં RNase H પ્રવૃત્તિ છે, જે સીડીએનએ ઉત્પાદનની લંબાઈને અસર કરી શકે છે (<4.5 kb નમૂનાઓ માટે યોગ્ય). પરંપરાગત રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શન માટે, TIANScript MMLV રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્ટેસની ભલામણ કરવામાં આવે છે. આ RTase અત્યંત નબળી RNase H પ્રવૃત્તિ સાથે સંશોધિત એન્ઝાઇમ છે, જે લાંબા (> 5 kb) cDNA સંશ્લેષણ માટે યોગ્ય છે.

વન-સ્ટેપ રિવર્સ ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શન અને પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન સીડીએનએ સિન્થેસિસ અને એમ્પ્લીફિકેશન વચ્ચે ટ્યુબ કવર ખોલ્યા વિના એક જ ટ્યુબમાં પૂર્ણ થાય છે, જે દૂષણ ઘટાડવામાં મદદરૂપ છે. મેળવેલા તમામ સીડીએનએ નમૂનાઓ એમ્પ્લીફિકેશન માટે ઉપયોગમાં લેવાતા હોવાથી, કુલ આરએનએના ન્યૂનતમ 0.01 પીજી સાથે સંવેદનશીલતા વધારે છે. સફળ એક-પગલાના RTPCR માટે, સામાન્ય રીતે જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ સીડીએનએ સંશ્લેષણ શરૂ કરવા માટે થાય છે. બે-પગલાની પદ્ધતિ, એટલે કે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન બે પગલાંમાં હાથ ધરવામાં આવે છે. સૌપ્રથમ સીડીએનએ મેળવવા માટે આરએનએ નમૂનામાંથી વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન હાથ ધરવામાં આવે છે, અને પ્રાપ્ત સીડીએનએ એક અથવા વધુ અલગ પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓને આધિન છે. સીડીએનએના પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડના સંશ્લેષણને માર્ગદર્શન આપવા માટે બે-પગલાની પદ્ધતિ ઓલિગો (ડીટી) અથવા રેન્ડમ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરી શકે છે, અને ચોક્કસ નમૂનામાંથી તમામ એમઆરએનએ માહિતીને ઉલટાવી શકે છે.