TIANSeq HiFi એમ્પ્લીફિકેશન મિક્સ

હાલમાં, હાઇ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજી મુખ્યત્વે આગામી પે generationીની સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજી પર આધારિત છે. આગલી પે generationીની સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજીની વાંચન લંબાઈ મર્યાદિત હોવાથી, આપણે સંપૂર્ણ લંબાઈનો ક્રમ નાના ટુકડા પુસ્તકાલયોમાં ક્રમમાં તોડી નાખવો જોઈએ. વિવિધ સિક્વન્સિંગ પ્રયોગોની જરૂરિયાતો અનુસાર, અમે સામાન્ય રીતે સિંગલ-એન્ડ સિક્વન્સિંગ અથવા ડબલ-એન્ડ સિક્વન્સિંગ પસંદ કરીએ છીએ. હાલમાં નેક્સ્ટ જનરેશન સિક્વન્સિંગ લાઇબ્રેરીના DNA ટુકડાઓ સામાન્ય રીતે 200-800 bp ની રેન્જમાં વહેંચવામાં આવે છે.

એ) ડીએનએ ગુણવત્તામાં નબળી છે અને તેમાં અવરોધકો છે. એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિને અટકાવવા માટે ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા ડીએનએ નમૂનાઓનો ઉપયોગ કરો.

b) DNA પુસ્તકાલય બનાવવા માટે PCR- મુક્ત પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરતી વખતે DNA સેમ્પલની માત્રા અપૂરતી છે. જ્યારે ખંડિત ડીએનએનું ઇનપુટ 50 એનજી કરતાં વધી જાય, ત્યારે પુસ્તકાલય નિર્માણ પ્રક્રિયા દરમિયાન પીસીઆર-મુક્ત કાર્યપ્રવાહ પસંદગીપૂર્વક હાથ ધરવામાં આવી શકે છે. જો લાઇબ્રેરીનો કોપી નંબર સીધો ક્રમ આપવા માટે ખૂબ ઓછો છે, તો એડેપ્ટર લિગેશન પછી ડીએનએ લાઇબ્રેરીને પીસીઆર દ્વારા વિસ્તૃત કરી શકાય છે.

સી) આરએનએ દૂષણ અચોક્કસ પ્રારંભિક ડીએનએ ક્વોન્ટિફિકેશન તરફ દોરી જાય છે આરએનએ દૂષણ જીનોમિક ડીએનએની શુદ્ધિકરણ પ્રક્રિયામાં અસ્તિત્વ ધરાવે છે, જે લાઇબ્રેરી બાંધકામ દરમિયાન અચોક્કસ ડીએનએ ક્વોન્ટિફિકેશન અને અપૂરતું ડીએનએ લોડિંગ તરફ દોરી શકે છે. RNase સાથે સારવાર કરીને RNA દૂર કરી શકાય છે.

એ -1

a) નાના ટુકડાઓ (60 bp-120 bp) દેખાય છે નાના ટુકડાઓ સામાન્ય રીતે એડેપ્ટર ટુકડાઓ અથવા એડેપ્ટરો દ્વારા રચાયેલા ડીમર હોય છે. એજેનકોર્ટ AMPure XP ચુંબકીય માળખા સાથે શુદ્ધિકરણ અસરકારક રીતે આ એડેપ્ટર ટુકડાઓ દૂર કરી શકે છે અને ક્રમની ગુણવત્તાની ખાતરી કરી શકે છે.

b) પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પછી લાઇબ્રેરીમાં મોટા ટુકડા દેખાય છે એડેપ્ટર લાઇગેટ થયા બાદ લાઇબ્રેરી ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટનું કદ 120 બીપી વધશે. જો એડેપ્ટર લિગેશન પછી ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટ 120 બીપીથી વધુ વધે છે, તો તે અતિશય પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનના અસામાન્ય ફ્રેગમેન્ટ એમ્પ્લીફિકેશનને કારણે થઈ શકે છે. પીસીઆર ચક્રની સંખ્યા ઘટાડવાથી પરિસ્થિતિ રોકી શકાય છે.

c) એડેપ્ટર લિગેશન પછી લાઇબ્રેરી DNA ટુકડાઓનું અસામાન્ય કદ આ કીટમાં એડેપ્ટરની લંબાઈ 60 bp છે. જ્યારે ટુકડાના બે છેડા એડેપ્ટરો સાથે જોડાયેલા હોય, ત્યારે લંબાઈ ફક્ત 120 બીપી વધશે. જ્યારે આ કીટ દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ સિવાયના એડેપ્ટરનો ઉપયોગ કરો, ત્યારે કૃપા કરીને એડેપ્ટરની લંબાઈ જેવી સંબંધિત માહિતી આપવા માટે સપ્લાયરનો સંપર્ક કરો. કૃપા કરીને ખાતરી કરો કે પ્રયોગ વર્કફ્લો અને કામગીરી મેન્યુઅલમાં વર્ણવેલ પગલાંને અનુસરે છે.

d) એડેપ્ટર લિગેશન પહેલા અસામાન્ય DNA ટુકડાનું કદ ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન દરમિયાન ખોટી પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિને કારણે આ સમસ્યાનું કારણ બની શકે છે. વિવિધ ડીએનએ ઇનપુટ માટે વિવિધ પ્રતિક્રિયા સમયનો ઉપયોગ કરવો જોઈએ. જો ડીએનએ ઇનપુટ 10 એનજી કરતા વધારે હોય, તો અમે ઓપ્ટિમાઇઝેશનના પ્રારંભિક સમય તરીકે 12 મિનિટનો પ્રતિક્રિયા સમય પસંદ કરવાની ભલામણ કરીએ છીએ, અને આ સમયે ઉત્પાદિત ટુકડાનું કદ મુખ્યત્વે 300-500 બીપીની રેન્જમાં છે. વપરાશકર્તાઓ ડીએનએ ટુકડાઓની લંબાઈને 2-4 મિનિટ સુધી વધારી અથવા ઘટાડી શકે છે જેથી જરૂરી કદ સાથે ડીએનએ ટુકડાઓને optimપ્ટિમાઇઝ કરી શકાય.

એ -2

એ) ફ્રેગમેન્ટેશન સમય optimપ્ટિમાઇઝ નથી જો ફ્રેગમેન્ટેડ ડીએનએ ખૂબ નાનું અથવા ખૂબ મોટું હોય, તો કૃપા કરીને પ્રતિક્રિયા સમય નક્કી કરવા માટે સૂચનામાં આપવામાં આવેલા ફ્રેગમેન્ટેશન ટાઇમ સિલેકશન માટેના માર્ગદર્શિકાઓનો સંદર્ભ લો, અને આ સમય બિંદુને નિયંત્રણ તરીકે ઉપયોગ કરો, વધુમાં સેટ કરો ફ્રેગમેન્ટેશન સમય પર વધુ સચોટ ગોઠવણ કરવા માટે 3 મિનિટ લંબાવવા અથવા ટૂંકી કરવાની પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી.

એ -3

ફ્રેગમેન્ટેશન ટ્રીટમેન્ટ પછી DNA નું અસામાન્ય કદનું વિતરણ

એ) ફ્રેગમેન્ટેશન રીએજન્ટની ખોટી પીગળવાની પદ્ધતિ, અથવા પીગળ્યા પછી રીએજન્ટ સંપૂર્ણપણે મિશ્રિત નથી. બરફ પર 5 × ફ્રેગમેન્ટેશન એન્ઝાઇમ મિક્સ રીએજન્ટને પીગળો. એકવાર પીગળી ગયા પછી, ટ્યુબના તળિયે હળવેથી ફ્લિક કરીને રીએજન્ટને સરખે ભાગે મિક્સ કરો. રીએજન્ટને વમળ ન આપો!

b) ડીએનએ ઇનપુટ નમૂનામાં EDTA અથવા અન્ય પ્રદૂષકો સમાયેલ છે, ડીએનએ શુદ્ધિકરણ પગલામાં મીઠાના આયનો અને ચેલેટીંગ એજન્ટોનું અવક્ષય પ્રયોગની સફળતા માટે ખાસ મહત્વનું છે. જો ડીએનએ 1 × TE માં ઓગળી જાય, તો ફ્રેગમેન્ટેશન કરવા માટે સૂચનામાં આપેલી પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરો. જો સોલ્યુશનમાં EDTA ની સાંદ્રતા અનિશ્ચિત હોય, તો ડીએનએને શુદ્ધ કરવાની અને અનુગામી પ્રતિક્રિયા માટે તેને ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં વિસર્જન કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

c) અચોક્કસ પ્રારંભિક ડીએનએ જથ્થામાં ખંડિત ડીએનએનું કદ ડીએનએ ઇનપુટની માત્રા સાથે નજીકથી સંબંધિત છે. ફ્રેગમેન્ટેશન ટ્રીટમેન્ટ પહેલાં, પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ડીએનએની ચોક્કસ માત્રા નક્કી કરવા માટે ક્યુબિટ, પીકોગ્રીન અને અન્ય પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએનું સચોટ પ્રમાણ જરૂરી છે.

 ડી) પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની તૈયારી સૂચનાને અનુસરતી નથી વિખંડિત પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની તૈયારી સૂચનાઓ અનુસાર બરફ પર સખત રીતે હાથ ધરવામાં આવવી જોઈએ. શ્રેષ્ઠ અસરની ખાતરી કરવા માટે, બધા પ્રતિક્રિયા ઘટકો બરફ પર મૂકવા જોઈએ અને સંપૂર્ણ ઠંડક પછી પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની તૈયારી હાથ ધરવી જોઈએ. તૈયારી પૂર્ણ થયા પછી, કૃપા કરીને સંપૂર્ણ રીતે ભળી જવા માટે ફ્લિક અથવા પાઇપેટ કરો. વમળ ન કરો!

1. અયોગ્ય મિશ્રણ પદ્ધતિ (વમળ, હિંસક ઓસિલેશન, વગેરે) પુસ્તકાલયના ટુકડાઓના અસામાન્ય વિતરણનું કારણ બનશે (નીચેની આકૃતિમાં બતાવ્યા પ્રમાણે), આમ પુસ્તકાલયની ગુણવત્તાને અસર કરશે. તેથી, ફ્રેગમેન્ટેશન મિક્સ રિએક્શન સોલ્યુશન તૈયાર કરતી વખતે, મહેરબાની કરીને મિશ્રણ કરવા માટે હળવેથી ઉપર અને નીચે પાઇપેટ કરો, અથવા આંગળીના ટેપનો ઉપયોગ કરો અને સમાનરૂપે મિક્સ કરો. વમળ સાથે ભળી ન જાય તેનું ધ્યાન રાખો.

2. પુસ્તકાલય બાંધકામ માટે ઉચ્ચ શુદ્ધતા DNA નો ઉપયોગ કરવો આવશ્યક છે

■ સારી ડીએનએ અખંડિતતા: ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ બેન્ડ પૂંછડી વગર 30 કેબીથી વધુ છે

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ડીએનએ ઇનપુટ જથ્થો સચોટ હોવો જોઈએ નેનોડ્રોપને બદલે ડીએનએને માપવા માટે ક્યુબિટ અને પીકોગ્રીન પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવાનું સૂચન કરવામાં આવે છે.

4. ડીએનએ સોલ્યુશનમાં ઇડીટીએની સામગ્રી નક્કી કરવી આવશ્યક છે ઇડીટીએ ફ્રેગમેન્ટેશન પ્રતિક્રિયા પર મોટો પ્રભાવ ધરાવે છે. જો EDTA ની સામગ્રી isંચી હોય, તો ડીએનએ શુદ્ધિકરણને અનુગામી પરીક્ષણ પહેલાં કરવાની જરૂર છે.

5. ફ્રેગમેન્ટેશન રિએક્શન સોલ્યુશન બરફ પર તૈયાર થવું જોઈએ ફ્રેગમેન્ટેશન પ્રક્રિયા પ્રતિક્રિયા તાપમાન અને સમય (ખાસ કરીને ઉન્નતકર્તા ઉમેર્યા પછી) પ્રત્યે સંવેદનશીલ હોય છે. પ્રતિક્રિયા સમયની ચોકસાઈની ખાતરી કરવા માટે, કૃપા કરીને બરફ પર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી તૈયાર કરો.

6. ફ્રેગમેન્ટેશન રિએક્શન ટાઇમ ચોક્કસ હોવો જોઇએ ફ્રેગમેન્ટેશન સ્ટેપનો રિએક્શન ટાઇમ ફ્રેગમેન્ટ પ્રોડક્ટ્સના કદને સીધી અસર કરશે, આમ લાઇબ્રેરીમાં ડીએનએ ટુકડાઓના કદ વિતરણને અસર કરશે.

1. આ કીટ પર કયા પ્રકારનો નમૂનો લાગુ પડે છે?

આ કિટનો લાગુ નમૂનો પ્રકાર સારી આરએનએ અખંડિતતા સાથે કુલ આરએનએ અથવા શુદ્ધ એમઆરએનએ હોઈ શકે છે. જો લાઇબ્રેરી બનાવવા માટે કુલ RNA નો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો પહેલા rRNA ને દૂર કરવા માટે rRNA ડિપ્લેશન કીટ (કેટ#4992363/4992364/4992391) નો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

2. શું FFPE નમૂનાઓનો ઉપયોગ આ કીટ સાથે પુસ્તકાલય બનાવવા માટે કરી શકાય?

FFPE નમૂનાઓમાં mRNA ચોક્કસ હદ સુધી ઘટશે, સંબંધિત નબળી અખંડિતતા સાથે. લાઇબ્રેરી બાંધકામ માટે આ કીટનો ઉપયોગ કરતી વખતે, ફ્રેગમેન્ટેશન સમયને શ્રેષ્ઠ બનાવવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે (ફ્રેગમેન્ટેશન સમય ઓછો કરવો અથવા ફ્રેગમેન્ટેશન ન કરવું).

3. પ્રોડક્ટ મેન્યુઅલમાં આપવામાં આવેલા કદ પસંદગી પગલાનો ઉપયોગ કરીને, શામેલ સેગમેન્ટમાં સહેજ વિચલન દેખાવાનું કારણ શું હોઈ શકે?

કદની પસંદગી આ ઉત્પાદન માર્ગદર્શિકામાં કદ પસંદગી પગલા અનુસાર કડક અનુસાર હાથ ધરવામાં આવશે. જો વિચલન હોય તો, કારણ એ હોઈ શકે છે કે ચુંબકીય માળખા ઓરડાના તાપમાને સંતુલિત નથી અથવા સંપૂર્ણપણે મિશ્રિત નથી, પાઇપેટ સચોટ નથી અથવા પ્રવાહી ટીપમાં રહે છે. પ્રયોગ માટે ઓછા શોષણ સાથે ટીપ્સનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

4. પુસ્તકાલય બાંધકામમાં એડેપ્ટરોની પસંદગી

લાઇબ્રેરી બાંધકામ કીટમાં એડેપ્ટર રીએજન્ટ નથી, અને આ કીટનો ઉપયોગ TIANSeq સિંગલ-ઇન્ડેક્સ એડેપ્ટર (ઇલુમિના) (4992641/4992642/4992378) સાથે કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

5. પુસ્તકાલયની QC

પુસ્તકાલયની માત્રાત્મક તપાસ: ક્યુબિટ અને ક્યુપીસીઆરનો ઉપયોગ અનુક્રમે ગ્રંથાલયની સામૂહિક સાંદ્રતા અને દાlarની સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે થાય છે. ઓપરેશન ઉત્પાદન મેન્યુઅલ અનુસાર સખત રીતે છે. પુસ્તકાલયની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે એનજીએસ સિક્વન્સિંગની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરશે. પુસ્તકાલય વિતરણ શ્રેણીની તપાસ: ગ્રંથાલય વિતરણ શ્રેણીને શોધવા માટે Agilent 2100 Bioanalyzer નો ઉપયોગ કરવો.

6. એમ્પ્લીફિકેશન સાયકલ નંબરની પસંદગી

સૂચનો અનુસાર, પીસીઆર ચક્રની સંખ્યા 6-12 છે, અને જરૂરી પીસીઆર ચક્રની સંખ્યા નમૂનાના ઇનપુટ અનુસાર પસંદ કરવી જોઈએ. ઉચ્ચ ઉપજ ધરાવતી લાઇબ્રેરીઓમાં, એમ્પ્લીફિકેશન સામાન્ય રીતે વિવિધ ડિગ્રીઓમાં થાય છે, જે એગિલેન્ટ 2100 બાયોએનાલિઝરની શોધમાં લક્ષ્ય શ્રેણીની ટોચ પછી સહેજ મોટા શિખર દ્વારા પ્રગટ થાય છે, અથવા ક્યુબિટની શોધાયેલ સાંદ્રતા qPCR કરતા ઓછી હોય છે. હળવું એમ્પ્લીફિકેશન એક સામાન્ય ઘટના છે, જે લાઇબ્રેરી ક્રમ અને અનુગામી ડેટા વિશ્લેષણને અસર કરતી નથી.

7. Agilent 2100 Bioanalyzer ની ડિટેક્શન પ્રોફાઇલમાં સ્પાઇક્સ દેખાય છે

Agilent 2100 Bioanalyzer શોધમાં સ્પાઇક્સનો દેખાવ નમૂનાઓના અસમાન વિભાજનને કારણે છે, જ્યાં ચોક્કસ કદમાં વધુ ટુકડાઓ હશે, અને PCR સંવર્ધન પછી આ વધુ સ્પષ્ટ બનશે. આ કિસ્સામાં, કદની પસંદગી ન કરવાનું સૂચન કરવામાં આવે છે, એટલે કે 15 મિનિટ ઉકાળવા માટે ફ્રેગમેન્ટેશનની સ્થિતિ 94 ° C પર સેટ કરો, જ્યાં ટુકડાનું વિતરણ નાનું અને કેન્દ્રિત હોય, અને એકરૂપતા સુધારી શકાય.